4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật:
Hình 1. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch
Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích
hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho
vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ
thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn
được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp
với phương pháp bảo quản này như: Staphylococi, Coliform có thể sống được vài năm theo cách
này. Cho dù phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và
sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu. Tuy nhiên, phương
pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:
- Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc.
- Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản.
- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản.
- Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp.
- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện
sau mỗi lần cấy truyền.
* Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:
Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này
các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau:
a. Trên đất, cát và silicagel. Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể
sống 4-5 năm khi bị làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học.
Ngày nay silicagel là chất mang được dùng phổ biến và có hiệu quả đối với bảo
quản nấm men, nấm sợi.
b. Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy
và sau đó được bọc bằng giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương pháp
này là bảo quản được lượng mẫu lớn.
c. Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch
huyền phù chủng vi sinh vật trong môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được
làm khô trong đĩa petri. Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài
năm.
Nhìn chung, không có phương pháp nào là vạn năng cho bảo quản các nhóm vi sinh vật khác
nhau. Thực ra là rất khó khi đánh giá một cách đầy đủ xét theo mọi yêu cầu đã được đặt ra ở trên.
Chính vì vậy mà các phương pháp bảo quản phải được kiểm nghiệm thực tế với từng loại vi sinh vật,
từ kết quả đó có thể chọn ra phương pháp thích hợp hoặc đồng thời sử dụng các phương pháp khác
nhau.
4.2. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông
khô trực tiếp:
a. Phương pháp đông khô:
Hình 2. Đông khô vi sinh vật.
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu.
Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường
chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu
được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả
cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số
virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động
vật.
b. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying):
Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô trực tiếp. Khác
biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không
thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước. Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi
khuẩn không có khả năng sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng
cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là:
- Tuổi của vi sinh vật bảo quản.
- Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật.
- Tốc độ đông khô.
- Nhiệt độ đông khô thấp nhất.
- Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu.
Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu. Thông thường
theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ 10-20 năm. Nói chung cả hai phương pháp này có
nhiều ưu điểm so với các phương pháp trước như thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm được công sức và
sai sót nhãn mác và tạp nhiễm. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành
thiết bị. Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau. Hơn thế
nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi trường thích hợp một số lần để
phục hồi các đặc tính sinh học.
4.3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu:
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể
và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196
°
C -> -80
°
C).
Hình 3. Bảo quản lạnh sâu
Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên
nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các
tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế
tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo
phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20
°
C, -30
°
C, -40
°
C,
-70
°
C, -140
°
C và -196
°
C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30
°
C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu
nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều
nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.
Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả.
Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm
men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số
nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ Đặc biệt
phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung
phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích
hợp với phương pháp đông khô.
Hình 4. Bảo quản trong nitơ lỏng.
5. Một số phương pháp phổ biến sử dụng trong bảo quản các
nhóm vi sinh vật cụ thể:
Trong phần này chúng tôi giới thiệu cụ thể một số phương pháp thông dụng nhất.
5.1. Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ
khuẩn:
Bảo quản vi khuẩn:
a. Phương pháp đông khô (Freeze drying/
lyophilization):
Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế giới. Phương
pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời
gian dài.
Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại NCTC (National
Colleciton Type Culture, Anh).
1, Nuôi vi khuẩn cho đông khô:
Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn
bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào
cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log.
2, Chuẩn bị đệm mẫu:
Có thể dùng một trong hai loại đệm sau:
+ Đệm huyết thanh- inositol;
Meso-inositol: 5 gam
Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml
Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào các bình vô trùng.
+ Đệm inositol:
Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam
Meso-inositol: 5 gam
Nước cất: đủ 100 ml.
Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121
O
C.
3, Chuẩn bị dịch tế bào:
Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường có thể thu sinh
khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật
độ vi khuẩn thông thường cần đạt 10
10
(đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm
với các vi sinh vật có bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường
hợp enterobacteria thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi
khuẩn.
4, Chuẩn bị ống đông khô:
Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được
rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp
thông thường.
5, Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô:
Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống đông khô
khoảng 0.1- 0.2 ml. Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống
đông khô.
6, Bước tiền đông khô:
Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá. Trước khi tiến hành
đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô
tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh
được tiến hành khoảng 3 giờ.
7, Tạo chỗ thắt trên ống đông khô:
Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết thắt được thực hiện với hệ thống
đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn và tạo vết thắt trên
thiết bị tự động.
8, Hậu đông khô:
Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt khoảng 1%. Thời
gian cho bước này có thể thay đổi từ 1-2 giờ.
9, Hàn ống đông khô:
Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và cẩn thận. Trước
hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực hiện thao tác hàn ống đông khô.
10, Kiểm tra độ chân không của ống đông khô:
Người ta sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu đạt độ chân không
cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu
hoặc màu tím đậm.
11, Kiểm tra khả năng sống của mẫu:
Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản. Việc đếm được
thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô. Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau
1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có
bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm. Tuy
nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh vật tiếp
xúc với oxy.
12, Bảo quản mẫu:
Mẫu thông thường được bảo quản tại 4
O
C hay nhiệt độ phòng.
b. Phương pháp giữ trong lạnh sâu:
1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu:
Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.
2, Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng 10%
và mật độ tế bào 10
6
.
3, Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống
thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống bị rò rỉ).
Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và
ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng.
Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3
O
C/phút để đạt tới nhiệt độ -30
O
C ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15
O
C/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100
O
C đến -80
O
C). Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh
sâu được chương trình hoá với tốc độ mong muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban
đầu được đặt trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ
-65
O
C.
4, Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng cách làm tan
nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37
O
C trong 40-60 giây). Như vậy, theo cách
trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản.
c. Một số phương pháp bảo quản khác: Bảo quản trên gelatin và silicagel.
Bảo quản xạ khuẩn:
Xạ khuẩn mang cả đặc tính của vi khuẩn và nấm sợi (có sợi và bào tử) do đó cần có những
phương pháp bảo quản thích hợp.
Thông thường xạ khuẩn cũng được bảo quản theo các cách thông thường như cấy truyền, đông
khô và lạnh sâu như với vi khuẩn ở trên. Tuy nhiên, có phương pháp kinh tế mà vẫn đảm bảo chất
lượng chủng bảo quản mà chúng tôi trình bày ở đây, đó là phương pháp bảo quản trong đất.
Các bước tiến hành bảo quản trong đất:
1, Chuẩn bị đất: lấy đất vườn làm khô tại 150
O
C trong 6 giờ để làm chết các vi sinh vật có bào
tử và trứng giun nếu có. Đất sau khi thanh trùng được nghiền nhỏ qua lưới có kích thước 30 mesh.
Đất sau khi nghiền được đưa vào ống nghiệm chuẩn bị nút bông và thanh trùng trong 60 phút. Trước
khi tiến hành bảo quản phải kiểm tra nhiễm sự khuẩn trong đất bằng cách cấy vòng que cấy đất từ
ống nghiệm đặt vào môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn và giữ ở 24
O
C, 28
O
C và 37
O
C, kiểm
tra sau 2-4 ngày.
2, Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn. Nước cất vô trùng được dùng để tạo dịch huyền phù xạ
khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng. Lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi ống
nghiệm và để khô tại nhiệt độ phòng (24
O
C) trong thời gian 1 tháng. Đập nhẹ vào thành ống cho các
hạt tách đều ra và bảo quản mẫu tại 4
O
C.
3, Hoạt hoá mẫu đơn giản bằng cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch hoặc dịch
thể) và để ở nhiệt độ thích hợp.
5.2. Bảo quản vi tảo:
Vi tảo thông thường được bảo quản theo 3 phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu và đông khô. Các
phương pháp đã được trình bày chi tiết trong phần vi khuẩn. Một số điểm cần chú ý khi bảo quản vi
tảo là ở chỗ: Nên dùng tế bào già ở pha cân bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết quả tốt hơn phương
pháp đông khô.
5.3. Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi:
a. Phương pháp cấy truyền:
Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các chủng nấm sợi được
nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau đó là quá
trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ được bảo quản theo các cách khác nhau:
- Các ống thạch được để trong tủ lạnh (4-7
O
C).
- Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp dầu parafin
có tỷ trọng tương đối là 0.83- 0.89 đã được khử trùng ở nhiệt độ 121
O
C trong 15 phút.
Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng 1 cm. Nhiệt độ bảo quản là 15-20
O
C.
- Bảo quản trong nước, nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch đĩa. Sau khi sợi phát
triển cực đại thì cắt thành từng miếng nhỏ kích thước khoảng 6 mm
2
và cho vào lọ nước
đã thanh trùng. Bảo quản tại nhiệt độ phòng.
b. Bảo quản nấm sợi có bào tử trong silicagel:
Chuẩn bị:
1, Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) thanh trùng ở nhiệt độ 170
O
C
trong 3 giờ.
2, Silicagel: Loại trong suốt, không có màu, kích thước và số lượng hạt silicagel đưa vào
không quá 1/3 thể tích của lọ, thanh trùng ở nhiệt độ 170
°
C trong 3 giờ.
3, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115
O
C/20 phút).
4, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng, môi trường
nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm
sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng
bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).
2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel. Chú ý silicagel hút nước và sinh
nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải được thực hiện trong chậu nước đá. Lượng dịch bào tử đưa
vào không vượt quá 1/3 thể tích hạt silicagel trong lọ. Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạt
silicagel đều dính dịch bào tử nấm sợi. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày
bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp
3, Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau đó giữ trong
bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25
O
C trong 1 tuần. Vặn chặt nút và quấn giấy parafil giữ trong 4
O
C.
Kiểm tra độ sống sót sau khi bảo quản:
Mẫu silicagel ở 4
°
C, dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên mặt thạch môi trường
mầm thóc (Maltagar), lắc đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường. Để ở nhiệt độ thích hợp,
kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp.
c. Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez-drying):
Chuẩn bị:
1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170
O
C trong 3 giờ.
2, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115
O
C/20 phút).
3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường
nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm
sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng
bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).
2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 - 0,3 ml), thông thường chuẩn
bị 13 ống cho mỗi chủng. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như mã số chủng, ngày bảo quản, môi
trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc.
3, Giữ ở -80
°
C trong 3 giờ trước khi tiến hành đông khô, đồng thời bật máy Dura-Stop, khi nhiệt
độ đạt -40
O
C, đưa mẫu vào tủ đông khô của Dura-Stop, bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không
đạt 45 minitor, nhiệt độ -55
O
C, tăng nhiệt độ Dura-Stop lên -5
O
C, để qua đêm.
4, Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25
°
C, khi đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không nhưng
không tắt Dura-Dry.
5, Tắt Dura-Stop, lần lượt nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy Dura-Dry, tiến hành
hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55
O
C.
Chú ý: Trong trường hợp chỉ dùng Dura-Dry có thể được thực hiện như sau:
- Tiến hành các bước 1,2,3,4 như trên.
- Mẫu được để tiền đông khô ở -80
°
C trong 3 giờ. Bật máy Dura-Dry, khi đạt nhiệt độ
-60
o
C đến -55
o
C, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành
hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55
o
C.
Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô:
1, Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột ngột bằng cồn
đốt.
2, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô
trùng làm tan đều mẫu đông khô. Hút toàn bộ dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất.
Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau (mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp và
nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một hướng như hình vẽ:
3, Sau đó đậy nắp đĩa, bao quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ thích hợp.
4, Cách đánh giá:
Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc.
Khá: 50 – 100 khuẩn lạc.
Trung bình: 10-50 khuẩn lạc.
Kém: < 10 khuẩn lạc.
Không mọc.
Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên. Tuy nhiên, có một số nấm sợi mà khuẩn
lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá như sau: Nếu các khuẩn lạc mọc đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt.
Mẻ đông khô là thành công nếu như số khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường trong
đĩa petri. Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi
đông khô như thay đổi môi trường sinh bào tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống
nghiệm bào tử nấm sợi.
d. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp:
Phương pháp đông khô trực tiếp thực hiện tương tự như phương pháp đông khô đã trình bày ở
trên và được thực hiện như sau:
Chuẩn bị:
1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170
o
C trong 3 giờ.
2, Môi trường L-drying chuẩn có thành phần như sau:
Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml.
Monosodium glutamat: 3 g
Adonitol: 1.5 g.
(Khử trùng ở 115
o
C/20 phút).
3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường
nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường đã thanh trùng ở trên cho vào ống nghiệm
chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao nhất (đối với một số
chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).
2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13
ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi
trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét