Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn

v
TÓM TẮT
Trong công nghệ nuôi tôm hiện nay, đặc biệt là các mô hình nuôi tôm mật độ
cao, việc áp dụng các giải pháp, phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng hiệu quả sản
xuất đóng góp đáng kể vào năng suất nuôi. Giải pháp quản lý sử sụng các sản phẩm
sinh học tăng cƣờng sức khỏe cho tôm thông qua việc tăng cƣờng hiệu quả đáp ứng
miễn dịch của tôm với mầm bệnh, nhất là với mầm bệnh virus, đƣợc xem là giải pháp
khá quan trọng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đánh giá sự thay đổi tính mẫn cảm
của tôm sú tiền trƣởng thành Penaeus monodon đối với virus đốm trắng (WSSV) sau
khi ứng dụng các giải pháp bổ sung các chất kích thích miễn dịch, vitamin C và β-
1,3/1,6-glucan vào thức ăn nuôi tôm trong khoảng thời gian nhất định. Sử dụng mô
hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng bởi Phòng thí nghiệm virus - Đại
học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ, kỹ thuật xét nghiệm hóa mô miễn dịch và phƣơng pháp
tiêm mô dịch gốc virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) đã đƣợc tinh sạch và
xác định độc lực thông qua chuẩn độ để xác định sự thay đổi độ mẫn cảm đối với virus
của tôm. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với hai liều tiêm cao và thấp của độ chuẩn SID
50

của dịch gốc WSSV-VN cho tôm sú tiền trƣởng thành sau khi đã nuôi với 3 nghiệm
thức thức ăn có bổ sung β-1,3/1,6-glucan (10g/kg thức ăn), bổ sung vitamin C (5g/kg
thức ăn) và không bổ sung trong thời gian 15 ngày. Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm ở
liều thấp (10
1,5
SID
50
) và liều cao (10
4
SID
50
) của dịch virus WSSV-VN cho 3 nhóm
tôm thuộc 3 nghiệm thức trên. Thu mẫu tôm ở các thời điểm khác nhau sau gây nhiễm:
0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giờ, để khảo sát sự thay đổi độ mẫn cảm
thông qua đánh giá sự biến đổi tình trạng sức khỏe tôm và tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV
trên tôm giữa các nghiệm thức. Kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm gây nhiễm với liều
thấp, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C
và đối chứng lần lƣợt là 4,12, 3,49 và 4,94%. Sự khác biệt về tỷ lệ tế bào nhiễm giữa 3
nghiệm thức này không có ý nghĩa (P>0,05). Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm
trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. Chƣa
thấy rõ sự khác biệt giữa nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Thí nghiệm gây
nhiễm với liều cao, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-
glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 3,04, 3,69 và 4,49%. Chỉ có sự khác biệt có
ý nghĩa (P<0,05) về tỷ lệ này giữa nghiệm thức đối chứng với β-1,3/1,6-glucan. Các





vi
dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so
với 2 nghiệm thức còn lại. β-1,3/1,6-glucan thể hiện rõ tác dụng làm giảm độ mẫn cảm
với WSSV của tôm sú. Trong từng phƣơng thức quản lý, tỷ lệ tế bào nhiễm ở 2 liều
tiêm không có sự khác biệt (P>0,05). Ở nhóm tiêm với liều cao, các dấu hiệu lâm sàng
của bệnh đốm trắng đến sớm hơn nhóm tiêm liều thấp.
































vii
MỤC LỤC

Trang tựa i
Lời cảm ơn iii
Tóm tắt iv
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt vii
Danh sách các bảng ix
Danh sách các hình x
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Nội dung 1
1.3 Mục tiêu 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú 3
2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú 5
2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng 5
2.2.2 Tác nhân gây bệnh 5
2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý 6
2.2.4 Phƣơng thức lan truyền 6
2.3 Các phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm đối với
bệnh đốm trắng 7
2.3.1 Chất kích thích miễn dịch 7
2.3.2 Vaccin 10
2.3.3 Vitamin 11
2.3.4 Fucoidan 12
2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm 13
2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 13
2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 14
2.5 Sơ lƣợc về hóa mô miễn dịch 15
2.5.1 Nguyên lý 15
2.5.2 Các phƣơng pháp nhuộm 15
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIỆN CỨU 16
3.1 Thời gian và địa điểm 16
3.2 Vật liệu nghiên cứu 16
3.2.1 Vật liệu sinh học 16
3.2.2 Dụng cụ và hóa chất 16
3.2.2.1 Dụng cụ 16
3.2.2.2 Hoa chất 17
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19
3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus 19
3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm WSSV trên tôm sú 19
3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC 19
3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC 19
3.3.5 Phƣơng pháp tính tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm thí nghiệm20
3.3.6 Phƣơng pháp đo một số yếu tố môi trƣờng nƣớc 20
3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 20





viii
3.4 Bố trí thí nghiệm 21
3.4.1 Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn 21
3.4.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN
đã chuẩn độ (10
5,2
SID
50
/ml) 21
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
4.1 Đáng giá vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn 23
4.2 Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn
cảm của tôm đối với WSSV 24
4.2.1 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều thấp
(10
1,5
SID
50
/ml) 24
4.2.2 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều cao
(10
1,5
SID
50
/ml) 28
4.2.3 Kết quả so sánh độ mẫn cảm với 2 liều gây nhiễm của tôm
ở từng phƣơng thức quản lý 32
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35
5.1 Kết luận 35
5.2 Đề nghị 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO …37



















ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

WSD: White spot disease.
WSSV: White spot syndrome Virus.
WSSV-VN: White spot syndrome virus Vietnam
IHC: Immunohistochemistry.
proPO: prophenoloxidase
LPS: Lipopolysaccharide
BGBP: Beta-glucan biding protein
VP19: envelope protein (19 kDa).
VP28: envelope protein (28 kDa).
DNA: Deoxiribonucleotide acid.
RNA: Ribonucleotide acid.
MBV: Monodon Baculovirus
YHV: Yellow Head Vius.
IHHNV: Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus.
PCR: Polymerase chain reaction.
PAP: peroxidase anti peroxidase
ABC: avidin-biotin complex
LSAB: labelled streptavidin-biotin
BPS: Buffer phosphate saline
DAB: 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride.
SID
50
/ml:

Shrimp infectious dose 50% enpoint













x
DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm nuôi tôm sú với các phƣơng thức quản lý
khác nhau 20
Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu ở mỗi đợt thí nghiệm 21
Bảng 4.1 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trƣờng trong quá trình thí
nghiệm 23
Bảng 4.2 Kết quả tăng trọng của tôm sau 15 ngày nuôi 23
Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm
trắng sau khi gây nhiễm liều thấp…………………………………………… 24
Bảng 4.4 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm kiểm tra bằng
IHC ở liều thấp 25
Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm bằng
IHC theo thời gian thu mẫu ở liều thấp………………………………………26
Bảng 4.6 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm
trắng sau khi gây nhiễm liều cao 28
Bảng 4.7 Kết quả tỷ lệ nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức ở liều cao 30
Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm bằng IHC ở
các thời điểm thu mẫu ở liều cao…… ………………………………………30
Bảng 4.9 So sánh kết quả theo dõi thực nghiệm và phân tích tỷ lệ cảm
nhiễm (IHC) giữa 2 liều tiêm……………………………………………… 32
Bảng 4.10 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở từng phƣơng thức quản lý
đƣợc gây nhiễm với 2 liều tiêm………………………………………………33











xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1 Sơ đồ sự kích hoạt của β-glucan và Lipopolysaccharide lên các tế
bào máu cùa giáp xác 4
Hình 2.2 Virus hội chứng đốm trắng 6
Hình 2.3 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV 6
Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của -1,3/1,6-glucan 9
Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của vitamin C 12
Hình 3.1 Gây nhiễm WSSV cho tôm bằng cách tiêm 19
Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát chẩn đoán IHC 20
Hình 3.2 Hình bố trí thí nghiệm cảm nhiễm WSSV cho tôm 21
Hình 4.1 Bể nuôi tôm với hệ thống lọc tuần hoàn 23
Hình 4.2 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X)
thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm WSSV 25
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều thấp 26
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian ở liều
thấp 26
Hình 4.3 Tôm đối chứng chết thời điểm 38 giờ sau gây nhiễm WSSV 29
Hình 4.4 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X)
thời điểm 12 giờ sau gây nhiễm WSSV ở liều cao 29
Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều cao 30
Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian thu mẫu ở liều
cao 31
Hình 4.5 Tôm đƣợc bổ sung β-1,3/1,6-glucan ở 120 giờ sau gây nhiễm 32







1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Từ thực tế phải đối đầu với bệnh đốm trắng (White Spot Disease – WSD) do
virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus – WSSV) gây nhiều thiệt
hại nặng nề cho ngành nuôi tôm Việt Nam cũng nhƣ thế giới trong những năm qua,
nhiều biện pháp kỹ thuật đã đƣợc nghiên cứu và áp dụng ở hầu hết các giai đoạn của
một vụ nuôi tạo nên giải pháp “phòng ngừa tổng hợp” nhằm hạn chế tối đa dịch bệnh
đốm trắng xảy ra.
Mặc dù vậy, cho đến nay biện pháp hữu hiệu để phòng bệnh đốm trắng trên tôm
vẫn còn bỏ ngỏ. Đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng các vaccine hay chất kích
thích miễn dịch (immunostimulants) nhằm nâng cao sức đề kháng của tôm đối với
WSSV. Tuy nhiên việc đánh giá một cách chính xác và khoa học hiệu quả của các biện
pháp này là rất khó.
Thông qua mô hình cảm nhiễm chuẩn, sẽ cho phép chúng ta đánh giá một cách
khoa học mức độ ảnh hƣởng của một số giải pháp kỹ thuật ứng dụng trong phòng bệnh
đốm trắng trên tôm nuôi, cụ thể là việc sử dụng các chất kích thích tăng cƣờng hệ miễn
dịch của tôm.
Đi từ cơ sở thực tiễn đó, đƣợc sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học
trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và sự chấp thuận của Viện
Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Ứng
dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của các phương
thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm đối với virus gây hội chứng đốm trắng
(White spot syndrome virus–WSSV) của tôm sú (Peneaus monodon)”.
1.2 Nội dung
Trong đề tài, chúng tôi bổ sung vào thức ăn cho tôm 2 hợp chất là Vitamin C và
-1,3/1,6-glucan, đƣợc xem nhƣ là các chất kích thích tăng cƣờng hoạt động của hệ
thống miễn dịch không đặc hiệu (insufficient immune system) của tôm, trong điều kiện
phòng thí nghiệm. Sau đó gây gây nhiễm các đàn tôm với 2 liều gây nhiễm 10
1,5
SID
50

và 10
4
SID
50
của dòng WSSV-VN đã đƣợc chuẩn độ trong cùng điều kiện. Thu mẫu và


2
tiến hành kiểm tra sự nhiễm WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC
(Immunohistochemistry).
1.3 Mục tiêu
Đánh giá ảnh hƣởng của hai hợp chất vitamin C và -1,3/1,6-glucan lên độ mẫn
cảm đối với WSSV của tôm sú.














3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú
Ngành nuôi tôm phát triển, tôm thƣờng đƣợc nuôi với mật độ cao trong môi
trƣờng tồn tại nhiều tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên ở điều kiện bình thƣờng thì giữa
sinh vật (vật chủ), mầm bệnh và môi trƣờng giữ trạng thái cân bằng. Bản thân vật chủ
duy trì cho mình tình trạng khoẻ mạnh bằng cách chống lại sự tấn công của các tác
nhân gây bệnh.
Cơ chế kháng bệnh chủ yếu của tôm sú là miễn dịch không đặc hiệu , điều này
có hạn chế so với động vật có xƣơng sống do sự khác biệt tiến hoá biểu hiện ở chỗ
không có và không tạo ra đƣợc kháng thể đáp ứng lại kháng nguyên lạ xâm nhập (Văn
Thị Hạnh và ctv, 2003). Lớp biểu bì là hàng rào lý hoá hữu hiệu chống lại sự bám dính
và xâm nhập của mầm bệnh. Một khi hàng rào này bị hƣ hại, các vi sinh vật đi vào cơ
thể, vào máu chúng sẽ gặp những cơ chế phòng vệ bẩm sinh bao gồm các đáp ứng
miễn dịch tế bào và thể dịch. Đầu tiên, hệ thống hoạt hoá prophenoloxidase (proPO)
đƣợc kích hoạt dẫn đến sự tổng hợp melanin và tạo ra các yếu tố liên quan đến các
phản ứng miễn dịch khác nhƣ peroxinectin. Tiếp đến, các tế bào máu tham gia vào
việc dọn dẹp các mầm bệnh bằng các cơ chế thực bào vi sinh vật hay bẫy chúng trong
các khối tế bào máu, đóng gói (encapsulation) các vi sinh vật lớn hơn. Các phản ứng
độc tế bào cũng đƣợc kích hoạt. Cuối cùng các phân tử cảm ứng nhƣ các peptide
kháng khuẩn, các yếu tố cần cho quá trình Opsonin cũng đƣợc tạo ra (Cerenius và
Söderhäll, 2004).
Theo Lê Hồng Phƣớc (2002), trong nghiên cứu về phản ứng loại thải vi sinh vật
của tế bào máu trên tôm sú, từ máu tôm sú có thể tìm thấy 5 lọai tế bào máu:
hyalinocyte (chiếm 37%), small-granular semi-granulocyte (25%), large-granular
semi-granulocyte (15%), small-granular granulocyte (6%) và large-granular
granulocyte (17%). Trong thí nghiệm này, tôm với trọng lƣợng trung bình
3,28 ± 1,12 g đƣợc tiêm vi khuẩn Gram âm Vibrio anguillarum với liều 30 µl/g tôm
(mật độ vi khuẩn: 107 – 108 CFU/ml). Sau 7 ngày tiêm, hầu hết không thấy sự hiện

Xem chi tiết: Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn